De lombrigas a humanos, a sinalização através da família de receptores de proteínas Notch impulsiona o desenvolvimento embrionário, a diferenciação celular e a homeostase dos tecidos. Também é absolutamente essencial para a transformação de células imunológicas humanas imaturas em células T – guerreiros celulares que atacam vírus e tumores.
No entanto, a ativação da sinalização Notch tem sido difícil de imitar em laboratório, tornando-a quase impossível de explorar na clínica e dificultando os esforços para gerar terapias com células T. Mas isso pode estar mudando.
Em julho, os participantes de uma conferência em Lewiston, Maine, dedicada à sinalização Notch, foram presenteados não com uma, mas com duas novas ferramentas para ativar o caminho. Sem o conhecimento um do outro, dois grupos de pesquisa trabalhavam em paralelo para desenvolver o que revelaram na conferência.
“Foi um ponto de viragem”, diz Juan Carlos Zúñiga-Pflücker, imunologista do desenvolvimento da Universidade de Toronto, no Canadá, cujo laboratório foi pioneiro em muitas técnicas de ativação Notch. Para ele, os anúncios representaram uma “espécie de ressurgimento” desse trabalho na área de Notch.
Problemas com 2D
A maioria dos receptores sofre algum tipo de mudança conformacional após se ligarem aos seus ligantes, levando a uma cadeia de eventos que altera o comportamento da célula. Mas a ligação do ligante por si só não é suficiente para ativar o Notch.
Uma vez que o receptor se liga ao seu ligante (que está preso a outra célula), a célula que expressa o ligante se enrola no complexo ligante-receptor. Como puxar um fio solto de um suéter, a força de tração resultante desfaz parte do receptor Notch, expondo-o a enzimas que liberam o domínio intracelular do receptor e permitem que ele viaje até o núcleo para influenciar a expressão genética.
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“O verdadeiro desafio tecnológico é criar um medicamento que possa imitar esse efeito de atração”, diz Vincent Luca, engenheiro de proteínas do Moffitt Cancer Center, em Tampa, Flórida.
As estratégias atuais requerem a cocultura de células que expressam o receptor Notch com células que expressam o ligante, ou a fixação do ligante em placas ou esferas. Mas esses métodos ‘2D’ não podem ser usados in vivodiz Lucas.
Eles também são um gargalo para a produção de células T em larga escala, diz George Daley, hematologista e biólogo de células-tronco da Harvard Medical School em Boston, Massachusetts, porque apenas as células nessa interface de apresentação do ligante podem ser ativadas. Durante anos, o laboratório de Daley lutou com as limitações dos métodos 2D enquanto tentava transformar células-tronco pluripotentes em células T.
Em 2021, Daley foi abordado por Rubul Mout, então pesquisador de pós-doutorado na Universidade de Washington, em Seattle, no laboratório de David Baker, que ganhou uma parte do Prêmio Nobel de Química de 2024 por seu trabalho em design de proteínas auxiliado por computador. Mout queria aplicar essas técnicas de design aos sistemas baseados em células-tronco de Daley.
Daley ficou “tremendamente entusiasmado” com a ideia, e antes mesmo de Mout ingressar oficialmente em seu laboratório, eles discutiram a engenharia de um agonista Notch solúvel – um que pudesse apresentar um ligante Notch às células em suspensão, em vez de em uma superfície plana.
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Usando a ferramenta de design de proteínas Rosetta desenvolvida no laboratório de Baker, Daley, Mout e seus colegas projetaram agonistas potenciais anexando múltiplas cópias do ligante a uma estrutura proteica. Eles experimentaram projetos com apenas duas e até 120 cópias do ligante, bem como geometrias diferentes.
Um arranjo funcionou particularmente bem: três cópias do ligante irradiando do andaime, como raios. Quando adicionado às células que expressam Notch em suspensão, este ligante multivalente uniu as células em um microscópio microscópico. passo de doiscom cada célula T em desenvolvimento puxando suavemente (e ativando) a outra. Em comparação com a ativação 2D, a ativação de Notch usando o agonista solúvel em um biorreator criou cinco vezes mais células T por micrograma de agonista1sugerindo que esta abordagem pode ser útil para a fabricação de células T em larga escala.
Aumentando o entalhe
Luca diz que seu grupo, por outro lado, estava em busca de uma “forma direcionada e focada de ativar o Notch”, com foco na terapêutica. Por exemplo, reforçar Notch poderia rejuvenescer células T exaustas que tentam destruir um tumor – mas isto deve ser feito sem ativar as células tumorais, que também expressam Notch.
O laboratório de Luca gerou SNAGs, agonistas sintéticos de Notch (ver ‘Imitação de entalhe’), fundindo um gene para um agonista de Notch com um que codifica um fragmento de anticorpo direcionado a células cancerígenas. O resultado codifica uma proteína biespecífica que forma o que Luca chama de “pequena ponte molecular” entre uma célula que expressa Notch e a célula que expressa o antígeno cancerígeno. Esse evento de ligação ativa mecanicamente o receptor de uma maneira semelhante à sinalização natural de Notch.2.
Fonte: Adaptado da ref. 2
Um agonista solúvel de Notch muito diferente foi revelado em janeiro. O biofísico Björn Högberg e a sua equipa do Instituto Karolinska, em Estocolmo, estudam as interações minúsculas e tácteis entre proteínas durante a sinalização celular, que Högberg compara a “um sistema Braille” que as células utilizam para comunicar umas com as outras.
Trabalhando com Luca, a equipe criou um agonista híbrido de DNA-proteína, anexando múltiplas cópias do ligante Notch ao longo de um pedaço de DNA que havia sido dobrado, no estilo origami, em uma haste. Para sua surpresa, o agonista ativou Notch sem gerar qualquer força de tração mensurável.3.
Os investigadores sugerem que o seu agonista de origami pode estar a desencadear um mecanismo alternativo de activação, no qual a ligação do ligando a longo prazo é suficiente para causar o desmembramento do receptor, embora a um ritmo muito mais lento. Mas eles ainda estão tentando entender como isso pode funcionar.
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As reações da comunidade sobre a possibilidade de um mecanismo de ativação Notch independente de extração foram variadas, diz Högberg: “Acho que alguns deles ficaram realmente intrigados e realmente queriam saber mais, e alguns deles disseram, ‘Eu não Não acho que isso seja alguma coisa.’”
Por sua vez, Zúñiga-Pflücker duvida que o ligante de origami funcione sem qualquer tipo de força de tração. Mas “o trabalho está muito bem feito”, diz ele, acrescentando que “todos os três artigos são bastante interessantes em diferentes aspectos”.
Há apenas alguns anos, diz Mout, de novo o design de proteínas não era avançado o suficiente para abordar a biologia significativa. Mas o campo está a evoluir rapidamente, diz ele, e problemas reais estão a ser resolvidos. “Tudo está se encaixando agora”, diz ele.
